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濕熱滅菌

濕熱滅菌法比干熱滅菌法更有效。濕熱滅菌是利用熱蒸汽滅菌。在相同溫度下,濕熱的效力比干熱滅菌好的原因是:①熱蒸汽對細胞成分的破壞作用更強。水分子的存在有助于破壞維持蛋白質三維結構的氫鍵和其他相互作用弱鍵,更易使蛋白質變性。蛋白質含水量與其凝固溫度成反比(表2-1);②熱蒸汽比熱空氣穿透力強,能更加有效地殺滅微生物:③蒸汽存在潛熱.當氣體轉變為液體時可放出大量熱量,故可迅速提高滅菌物體的溫度。 
多數細菌和真菌的營養細胞在60℃左右處理15min后即可殺死,酵母菌和真菌的胞子要耐熱些,要用80℃以上的溫度處理才能殺死,而細菌的芽胞更耐熱,一般要在120℃下處理15min才能殺死。濕熱滅菌常用的方法有常壓蒸汽滅菌和高壓蒸汽滅菌。
(一)常壓蒸汽滅菌 
    (1)常壓蒸汽滅菌是濕熱滅菌的方法之一,在不能密閉的容器里產生蒸汽進行滅菌。在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下,常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌方法。此外,不宜用高壓蒸煮的物質如糖液、牛奶、明膠等,可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法所用的滅菌器有阿諾氏(Aruokd)滅菌器或特制的蒸鍋,也可用普通的蒸籠。由于常壓蒸汽的溫度不超過100℃,壓力為常壓,大多數微生物的營養細胞能被殺死,但芽胞細菌卻不能在短時間內死亡,因此必須采取間歇滅菌或持續滅菌的方法,以殺死芽胞細菌,達到完全滅菌。     1)巴氏消毒法  是用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進行高溫滅菌的液體的一種消毒方法,其主要目的是殺死其中的無芽胞病原菌(如牛奶中的結核分枝桿菌或沙門氏菌),而又不影響其特有風味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法,具體的處理溫度和時間各有不同,一般在60-85℃下處理15-30min。具體的方 法可分兩類,**類是較老式的,稱為低溫維持法,例如在63℃下保持30min可進行牛奶消毒;另一類是較新式的,稱為高溫快速法,用于牛奶消毒時只要在85℃下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能殺滅引起Q熱的病原體--伯氏考克斯氏體(一種立克次氏體)。 
    2)間歇滅菌法  又稱分段滅菌法。適用于不耐熱培養基的滅菌。方法是:將待滅菌的培養基在100℃下蒸煮30-60min,以殺死其中所有微生物的營養細胞,然后置室溫或20-30℃下保溫過夜,誘導殘留的芽胞萌發,第二天再以同法蒸煮和保溫過夜,如此連續重復3天,即可在較低溫度下達到徹底滅菌的效果。例如,培養硫細菌的含硫培養基就應用間歇滅菌法滅菌,因為其中的元素硫經常規的高壓滅菌(12l℃)后會發生熔化,而在100℃的溫度下則呈結晶狀。 3)蒸汽持續滅菌法  微生物制品的土法生產或食用菌菌種制備時常用這種方法。在容量較大的蒸鍋中進行。從蒸汽大量產生開始,繼續加大火力保持充足蒸汽,待鍋內溫度達到100℃時,持續加熱3-6h,殺死jue大部分芽胞和全部營養體,達到滅菌目的。 
    以上三種方法通常是在無高壓蒸汽滅菌條件的地方(如農村)使用。     (2)滅菌過程中應注意 
    1)使用間歇法或持續法滅菌時必須在滅菌物里外都達到100℃后開始計算滅菌時間,此時鍋頂上應有大量蒸汽冒出。 
    2)為利于蒸汽穿透滅菌物,鍋內或蒸籠上堆放物品不宜過滿過擠,應留有空隙。固體曲料大量滅菌時,每袋以1.5-2.0kg為宜,料袋在鍋內用蓖子分層隔開,不能堆壓在一起。 
    3)火大水足才能保證蒸汽足,蒸鍋里應先把水加足。一次持續滅菌時,如鍋內盛水量不能維持到底.應在蒸鍋側面安裝加水口,以便在蒸煮過程中添水。添水應用開水,以防驟然降溫。 
    4)間歇法滅菌時應在每次加熱后,迅速降溫,然后在室溫放置24h,再第二次加熱。如果降溫慢,往往使未殺死的雜菌大量滋長,反面導致滅菌物變質,特別是固體曲料包裝過大時,靠近中心部分更易發生這種情況。 
    5)從使用效果看,分裝試管、三角瓶或其他容器的培養基,因其體積小,透熱快以用間歇法為佳。固體曲料,因其包裝較大,透熱慢,用間歇法容易滋生雜菌變質或者水分蒸發過多,曲料變得不新鮮,影響培養效果,因此使用一次持續滅菌法較好。   (二)高壓蒸汽滅菌 
    高壓蒸汽滅菌法是微生物學研究和教學中應用**廣、效果**好的濕熱滅菌方法。     (1)滅菌原理 
    高壓蒸汽滅菌是在密閉的高壓蒸汽滅菌器(鍋)中進行的。其原理是:將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內。把鍋內的水加熱煮沸,并把其中原有的冷空氣徹底驅盡后將鍋密閉。再繼續加熱就會使鍋內的蒸汽壓逐漸上升,從而溫度也隨之上升到100℃以上。為達到良好的滅菌效果,一般要求溫度應達到121℃(壓力為0.1MPa),時間維持15-30min。也可采用在較低的溫度(115℃,即0.075MPa)下維持35min的方法。此法適合于一切微生物學實驗室、醫療保健機構或發酵工廠中對培養基及多種器材、物品的滅菌。蒸汽壓力與溫度的關系如表2-2所示。 
在使用高壓蒸汽滅菌器進行滅菌時,蒸汽滅菌器內冷空氣的排除是否完全極為重要,因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓;所以當水蒸汽中含有空氣時,壓力表所表示的壓力是水蒸氣壓力和部分空氣壓力的總和,不是水蒸氣的實際壓力.它所相當的溫度與高壓滅菌周內的溫度是不一致的。這是因為在同一壓力下的實際溫度,含空氣的蒸汽低于飽和蒸汽。見表2-3所示。#p#分頁標題#e#
 
由上表看出:如不將滅菌鍋中的空氣排除干凈,即達不到滅菌所需的實際溫度。因此,必須將滅菌器內的冷空氣完全排除,才能達到完全滅菌的目的。 
    在空氣完全排除的情況下,一般培養基只需在0.1MPa下滅菌30min即可。但對某些物體較大或蒸汽不易穿透的滅菌物品,如固體曲料、土壤和草炭等,則應適當延長滅菌時間,或將蒸汽壓力升到0.15MPa保持1-2h。     (2)滅菌設備 
    高壓蒸汽滅菌的主要設備是高壓蒸汽滅菌鍋,有立式、臥式(圖2-5)及手提式(圖2-6)等不同類型。實驗室中以手提式**為常用。臥式滅菌鍋常用于大批量物品的滅菌。不同類型的滅菌鍋,雖大小外形各異。但其主要結構基本相同。

 
高壓蒸汽滅菌器的基本構造如下: 
    1)外鍋  或稱“套層”,供貯存蒸汽用,連有用電加熱的蒸汽發生器,并有水位玻管以標志盛水量。外鍋的外側一般包有石棉或玻璃棉jue緣層以防止散熱。如直接使用由鍋爐接入的高壓蒸汽,則外鍋在使用時充滿蒸汽,作為內鍋保溫之內鍋  或稱滅菌室,是放置滅菌物的空間.可配制鐵蓖架以分放滅菌物     3)壓力表  內外鍋各裝一只,老式的壓力表上標明三種單位:公斤壓力單位(kg/cm2),英制壓力單位(1b/in2)和溫度單位(℃),便于滅菌時參照?,F在的壓力表用MPa表示。 
    4)溫度計  可分為兩種,一種是直接插入式的水銀溫度計,裝在密閉的銅管內,焊插在內鍋中.另一種是感應式儀表溫度計,其感應部分安裝在內鍋的排氣管內,儀表安裝于鍋外頂部.便于觀察。
5)排氣閥  一般外鍋、內鍋各一個,用于排除空氣。新型的滅菌器多在排氣閥外裝有汽液分離器(或稱疏水閥).內有由膨脹盒控制的活塞。利用空氣、冷凝水與蒸汽之間的溫差控制開關,在滅菌過程中,可不斷地自動排出空氣和冷凝水。 
6)安全閥  或稱保險閥.利用可調彈簧控制活塞,超過額定壓力即自動放氣減壓。通常調在額定壓力之下,略高于使用壓力。安全閥只供超壓時安全報警之用,不可在保溫時用作自動減壓裝置。 
    7)熱源  除直接引入鍋爐蒸汽滅菌外,都具有加熱裝置。近年來的產品以電熱為主,即底部裝有調控電熱管,使用比較方便。有些產品無電熱裝置,則附有打氣煤油爐等。手提式滅菌器也可用煤炭爐作為熱源。 
    (3)幾種常用高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法     1)立式滅菌鍋使用要點: 
    ①加水  由漏斗處加水,加水量應在標定水位線以上,可在水位玻管刻度處觀察。 
    ⑦裝鍋  將待滅菌物品裝入鍋內時,不要太緊太滿,應留有間隙,以利蒸汽流通。蓋好鍋蓋后。即可將螺旋柄旋緊。 
    ③加熱和排冷空氣  如果是電熱高壓蒸汽滅菌鍋,則合上電閘通電加熱。如屆非電熱裝置,可點燃煤氣爐或煤油噴燈加溫。同時打開排氣閥及下部排冷氣余水閥,繼續加熱到鍋中水沸騰,待排氣閥冒出大量蒸汽后,關閉蓋頂排氣活塞,使冷空氣由下部疏水閥排出。此時如有少量冷凝水排出是正常現象。待下部疏水閥有大量蒸汽冒出時,證明鍋中已充滿蒸汽,應繼續排汽,使鍋中及滅菌容器中的冷空氣完全排除干凈。一般不應少于5min。 
    ④升壓保壓  排氣完畢后.關小下部疏水閥,鍋內壓力即逐漸升高,注意升壓不要過猛。當壓力升高到0.lMPa時,調節火力,使壓力保持穩定。壓力選擇應視具體滅菌物品而定,如草炭、土壤等則可在壓力升**0.14MPa-0.15MPa后定時保壓。 
    ⑤降壓與排汽  保壓時間(一般為30min)結束后,即應停止加熱,使其自然冷卻。此時切勿急于打開排氣塞,因為壓力驟然降低,將導致培養基劇烈沸騰而沖掉或污染棉塞。待壓力降**0.025MPa以下可打開排氣閥使余汽排出,同時打開下部疏水閥,排出鍋內冷凝水。 
    ⑧出鍋  排氣完畢后,即可扭松螺旋柄使鍋蓋松動。先將鍋蓋打開5-10cm,不必完全推開鍋蓋,  目的是借鍋中余熱將棉塞及包裝紙烘干。烘烤30min后,即可推開鍋蓋,取出已滅菌的物品。     2)臥式滅菌鍋使用要點: 
    ①加水  先將排水閥關閉,調整總閥**“全排”。然后,開啟進水閥,放蒸餾水**蒸汽發生器內,待水進**距水表頂端大約1-2cm處時,關閉進水閥,并將總閥調**“關閉”。 
    ⑦裝鍋  將待滅菌物品裝入鍋內,注意不要塞得過緊過滿,盛有培養基的三角瓶和試管應立放或適度傾斜.以免滅菌過程中培養基污染棉塞。 
    ②關門  按順時針方向轉動緊鎖手柄**紅箭頭處,使撐擋進入門圈內。然后旋動八角轉盤,使門和墊圈密合,以滅菌時不漏氣為度,不宜太緊,以免損壞墊圈。 
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    ④通電加溫  待電源控制開關的旋鈕旋**“開”處,電源指示燈亮,表示已通電,然后再按滅菌物品所需滅菌汽壓將旋切旋**0.07MPa、0.1mPa或0.14MPs處。此時電熱指示燈亮,表示已通電加熱。⑤保溫保壓  當蒸汽套層內的蒸汽隨加熱達到自動控制壓力時,電熱指示燈會白動熄滅,表示停止加熱。隨著熱力散發壓力降低,電熱指示燈再亮,表示繼續加熱,這表明壓力控制器工作正常。當套層內的蒸汽加熱到所選擇的控制壓力時,即可將套層內的蒸汽導入消毒室進行滅菌。此時應先將汽液分離器前的冷凝閥開放少許,然后將總閥調**“消毒”,套層內的蒸汽即通過總閥進入消毒室進行消毒,冷凝水則通過汽液分離器自動排出。這時蒸汽套層內蒸汽壓力迅速下降,而消毒室內的蒸汽壓力逐漸上升,消毒室內的溫度表也隨著物品被蒸汽加熱而上升。當表卜溫度升到所需消毒溫度(一般為121℃)時,開始計算滅菌時間,維持溫度**滅菌完畢。 
    ⑧出鍋  滅菌完畢后,立即切斷電源,按滅菌物品性質和要求,決定消毒室內的蒸汽是自然冷卻還是采取“慢排”或“快排”,例如,器械、器皿、固體曲料、土壤、草炭等不致因壓力驟然下降而受影響的物品,可直接將總閥調**“慢排”和“快排”,使消毒室內蒸汽迅速排出。當消毒室內壓力下降**“0”時,方可緩慢轉動鍋門轉盤并撥動緊鎖手柄將門開啟5-10 cm。20一30min后將滅菌物品取出,此時滅菌物品即較干燥。溶液及培養基等物品滅菌完畢時,只能將總閥調**“慢排”,使消毒室內蒸汽慢慢排出,以免突然降低壓力導致培養基劇烈沸騰。也可在滅菌完畢后,關閉總閥,讓滅菌物品自然冷卻。消毒寶壓力表降**“0”時、再將總閥調**“慢排”數分鐘取出滅菌物品。 
    ⑦連續操作  如滅菌物品較多需連續操作時,應先檢查水位。有足夠水量時,可連續使用。如需加水、應把總閥調**“全排”,打開進水閥加水后繼續操作。    ⑧保養  每次滅菌完畢后,關閉電源,停止加熱,隨后將總閥調**“全排”,排出套層內的蒸汽。開啟鉑門少許,散發剩余蒸汽,使消毒室內壁經常保持干燥,同時排除蒸汽發生器內的余水。     3)手提式滅菌鍋使用要點: 
    ①加水  使用前在鍋內加入適量的水,加水不可過少,以防將滅菌鍋燒干,引起炸裂事故。加水過多有可能引起滅菌物積水。 
    ②裝鍋  將滅菌物品放在滅菌捅中,不要裝得過滿。蓋好鍋蓋,按對稱方法旋緊四周固定螺旋,打開排氣閥。 
    ③加熱排汽  加熱后待鍋內沸騰并有大量蒸汽自排氣閥冒出時.維持2-3min以排除冷空氣。如滅菌物品較大或不易透氣,應適當延長排氣時間,務必使空氣充分排除,然后將排氣閥關閉。 
    ④保溫保壓  當壓力升**0.1MPa時,溫度達12l℃,此時應控制熱源。保持壓力,維持30min后,切斷熱源。 
    ⑤出鍋  當壓力表降**“0”處,稍停,使溫度繼續降**100℃以下后,打開排氣閥,旋開固定螺旋.開蓋,取出滅菌物。注意:切勿在鍋內壓力尚在“0”點以上,溫度也在100℃以上時開啟排氣閥,否則會因壓力驟然降低,而造成培養基劇烈沸騰沖出管口或瓶口,污染棉塞,以后培養時引起雜菌污染。     ⑥保養  滅菌完畢取出物品后,將鍋內余水倒出,以保持內壁及內膽干燥,蓋好鍋蓋。
 
 
 
 

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