干熱滅菌法驗證與濕熱滅菌法相同，應進行熱分布試驗、熱穿透試驗、生物指示劑驗證試驗或細菌內毒素滅活驗證試驗。以確認滅菌柜中的溫度分布符合設定的標準、確定**冷點位置、確認**冷點標準滅菌時間（FH）能達到設定標準并達到SAL要求。常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)。細菌內毒素滅活驗證試驗是證明除熱原過程有效性的試驗。一般將不小于1000單位的細菌內毒素加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內毒素**少下降3個對數(shù)單位。細菌內毒素滅活驗證試驗所用的細菌內毒素一般為大腸桿菌內毒素（Escherichia coli endoxin）。驗證時，一般采用**大裝載方式。 #p#分頁標題#e#
本法系指將滅菌產(chǎn)品置于適宜放射源輻射的γ射線或適宜的電子加速器發(fā)生的電子束中進行電離輻射而達到殺滅微生物的方法。本法**常用的為60Co-γ射線輻射滅菌。醫(yī)療器械、容器、生產(chǎn)輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等均可用本法滅菌。
采用輻射滅菌法滅菌的無菌產(chǎn)品其SAL應≤10-6。γ射線輻射滅菌所控的參數(shù)主要是輻射劑量（指滅菌物品的吸收劑量）。該劑量的制定應考慮滅菌物品的適應性及可能污染的微生物**大數(shù)量及**強抗輻射力，所使用的劑量事先應驗證其有效性及安全性。常用的輻射滅菌吸收劑量為25kGy。對**終產(chǎn)品、原料藥、某些醫(yī)療器材應盡可能采用低輻射劑量滅菌。滅菌前，應對被滅菌物品微生物污染的數(shù)量和抗輻射強度進行測定，以評價滅菌過程賦予該滅菌物品的無菌保證水平。 滅菌時，應采用適當?shù)幕瘜W或物理方法對滅菌物品吸收的輻射劑量進行監(jiān)控，以充分證實滅菌物品吸收的劑量是在規(guī)定的限度內。如采用與滅菌物品一起被輻射的放射性劑量計，劑量計要置于規(guī)定的部位。在初安裝時劑量計應用標準源進行校正，并定期進行再校正。
本法系指用化學消毒劑形成的氣體殺滅微生物的方法。在充有滅菌氣體的高壓腔室內進行。常用的化學消毒劑有環(huán)氧乙烷、氣態(tài)過氧化氫、甲醛、臭氧（O3）等，本法適用于在氣體中穩(wěn)定的物品滅菌。采用氣體滅菌法時，應注意滅菌氣體的可燃可爆性、致畸性和殘留毒性。 本法中**常用的氣體是環(huán)氧乙烷，一般與80％～90％的惰性氣體混合使用。該法可用于醫(yī)療器械，塑料制品等不能采用高溫滅菌的物品滅菌。含氯的物品及能吸附環(huán)氧乙烷的物品則不宜使用。另外，使用氣態(tài)過氧化氫和臭氧（O3）滅菌，因其無危害性殘留物，不會對操作人員和環(huán)境造成危害，適合于空間和物品表面的滅菌。
采用環(huán)氧乙烷滅菌時，滅菌柜內的溫度、濕度、滅菌氣體濃度、滅菌時間是影響滅菌效果的重要因數(shù)。可采用下列滅菌條件： 溫度 （ 54 ±10）℃ 相對濕度 （60±10）% 滅菌壓力 8×105Pa 滅菌時間 90min
滅菌條件應予驗證。滅菌時，先將滅菌腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室內達到設定的
溫濕度平衡的額定值，再通入經(jīng)過濾和預熱的環(huán)氧乙烷氣體。滅菌過程中，應嚴密監(jiān)控腔室的溫度、濕度、壓力、環(huán)氧乙烷濃度及滅菌時間。必要時使用生物指示劑監(jiān)控滅菌效果。本法滅菌程序的控制具有一定難度，整個滅菌過程應在技術熟練人員的監(jiān)督下進行。滅菌后，應采取新鮮空氣置換，使殘留環(huán)氧乙烷和其他易揮發(fā)性殘渣消散。并對環(huán)氧乙烷殘留物和反應產(chǎn)物進行監(jiān)控，以證明其不超過規(guī)定濃度，避免產(chǎn)生毒性。
環(huán)氧乙烷滅菌法驗證時，應進行如下試驗：泄漏試驗，以確認滅菌腔室的密閉性；生物指示劑的驗證試驗，指示劑一般采用枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)；滅菌后換氣次數(shù)的驗證試驗，確認環(huán)氧乙烷及相應的反應產(chǎn)物含量在限定的范圍內。驗證設計時，還應考慮物品包裝材料和滅菌腔室中物品的排列方式對滅菌氣體的擴散和滲透的影響。 五、過濾除菌法
本法系利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。常用于熱不穩(wěn)定的藥品溶液或原料的除菌。除菌過濾器采用孔徑分布均勻的微孔濾膜作過濾材料，微孔濾膜分親水性和疏水性兩種。濾膜材質依過濾物品的性質及過濾目的而定。藥品生產(chǎn)中采用的除菌濾膜孔徑一般不超過0.22μm。過濾器不得對被濾過成分有吸附作用，也不能釋放物質，不得有纖維脫落，禁用含石棉的過濾器。濾器和濾膜在使用前應進行潔凈處理，并用高壓蒸汽進行滅菌或作在線滅菌。更換品種和批次應先清洗濾器，再更換濾膜。 過濾過程中無菌保證與過濾液體的初始生物負荷及過濾器的對數(shù)下降值LRV(Log Reduction Value)有關。LRV系指規(guī)定條件下，被過濾液體過濾前的微生物數(shù)量與過濾后的微生物數(shù)量比的常用對數(shù)值。 即： LRV=lgN0- LgN 式中N0為產(chǎn)品除菌前的微生物數(shù)量。 N 為產(chǎn)品除菌后的微生物數(shù)量。
LRV用于表示過濾器的過濾除菌效率，對孔徑為0.22μm的過濾器而言，要求每1cm2有效過濾面積的LRV應不小于7。因此過濾除菌時，被過濾產(chǎn)品總的污染量應控制在規(guī)定的限度內。為保證過濾除菌效果，可使用兩個過濾器串連過濾，或在灌裝前用過濾器進行再次過濾。 在過濾除菌中，一般無法對全過程中過濾器的關鍵參數(shù)（濾膜孔徑的大小及分布，濾膜的完整性及LRV）進行監(jiān)控。因此，在每一次過濾除菌前后均應作濾器的完整性試驗，即氣泡點試驗或壓力維持試驗或#p#分頁標題#e#氣體擴散流量試驗。確認濾膜在除菌過濾過程中的有效性和完整性。除菌過濾器的使用時間不應超過一個工作日，否則應進行驗證。 過濾系統(tǒng)的驗證包括過濾系統(tǒng)對過濾液體的適應性、過濾材料對溶液的污染程度、過濾器的規(guī)格、過濾器的滅菌方法、過濾系統(tǒng)的完整性試驗、生物指示劑試驗、過濾液體的微生物含量控制及過濾時間、過濾器的使用壽命等。上述試驗大部分可由濾器的生產(chǎn)廠商來進行。微生物挑戰(zhàn)性試驗常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta)。
通過過濾除菌法達到無菌的產(chǎn)品應嚴密監(jiān)控其生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，建議在無菌環(huán)境下進行過濾操作。相關的設備、包裝容器、塞子及其它物品應采用適當?shù)姆椒ㄟM行滅菌，并防止再污染。 六、無菌生產(chǎn)工藝
無菌生產(chǎn)工藝系指必須在無菌控制條件下生產(chǎn)無菌制劑的方法，無菌分裝及無菌凍干是**常見的無菌生產(chǎn)工藝。后者在工藝過程中須采用過濾除菌法。
無菌生產(chǎn)工藝應嚴密監(jiān)控其生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，并應在無菌控制的環(huán)境下進行過濾操作。相關的設備、包裝容器、塞子及其它物品應采用適當?shù)姆椒ㄟM行滅菌，并防止被再次污染。無菌生產(chǎn)工藝過程的無菌保證應通過培養(yǎng)基無菌灌裝摸擬試驗驗證，試驗結果的陽性率不得超過0.1%(置信度取95%)。在生產(chǎn)過程中，應嚴密監(jiān)控生產(chǎn)環(huán)境的無菌空氣質量、操作人員的素質、各物品的無菌性。
無菌生產(chǎn)工藝應定期進行驗證，包括對環(huán)境空氣過濾系統(tǒng)有效性驗證及培養(yǎng)基模擬灌裝試驗。
生物指示劑
生物指示劑系一類特殊的活微生物制品。可用于確認滅菌設備的性能、滅菌程序的驗證、生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控等。用于滅菌驗證中的生物指示劑一般是細菌的孢子。 1.制備生物指示劑用微生物的基本要求
不同的滅菌方法使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物必須具備以下特性：
(1) (1) 菌種的耐受性應大于需滅菌產(chǎn)品中所有可能污染微生物的耐受性。
(2) (2) 菌種應無致病性。
(3) (3) 菌株應穩(wěn)定。存活期長，易于保存。
(4) 易于培養(yǎng)。若使用休眠孢子，生物指示劑中休眠孢子含量要在90%以上。
1. 1. 生物指示劑的制備
生物指示劑的制備應按一定的程序進行，制備前，需先確定所用微生物的特性，
如D值（微生物的耐熱參數(shù)，系指一定溫度下，將微生物殺滅90%所需的時間，以分表示）值等。菌株應用適宜的培養(yǎng)基（如產(chǎn)孢子的培養(yǎng)基）進行培養(yǎng)。培養(yǎng)物應制成懸浮液，其中孢子的數(shù)量應占優(yōu)勢，孢子應懸浮于無營養(yǎng)的液體中保存。
生物指示劑中包含一定數(shù)量的一種或多種孢子，可制成多種形式，通常是將一定數(shù)量的孢子附著在無生命的載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等；孢子懸浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示劑還配有培養(yǎng)基系統(tǒng)。生物指示劑應選用合適的材料包裝，并設定 有效期。載體和包裝材料在保護生物指示劑不被污染和損耗的同時，還應保證滅菌劑穿透并能與生物指示劑充分接觸。載體和包裝應設計原則是便于貯存、運輸、取樣、轉移接種。
有些生物指示劑可直接將孢子接種**液體滅菌物或具有與其相似的物理和化學特性的替代品中。使用替代品時，應用數(shù)據(jù)證明二者的等效性。1. 2. 生物指示劑的應用
在滅菌程序的驗證中，盡管可通過滅菌過程某些參數(shù)的監(jiān)控來評估滅菌效果，但生物指示劑的被殺滅程度，則是評價一個滅菌程序有效性**直觀的指標。可使用市售的標準生物指示劑，也可使用由日常生產(chǎn)污染菌監(jiān)控中分離的**耐受微生物制備的孢子。在生物指示劑驗證試驗中，需確定孢子在實際滅菌條件下的耐受性，并測定孢子的純度和數(shù)量。驗證時，生物指示劑的微生物用量應比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強，以保證滅菌程序有更大的安全性。在**終滅菌法中，生物指示劑應放在滅菌柜的不同部位。并避免指示劑直接接觸到被滅菌物品。生物指示劑按設定的條件滅菌后取出，分別置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定生物指示劑中的孢子是否被完全殺滅。
過度殺滅產(chǎn)品滅菌驗證一般不考慮微生物污染水平，可采用市售的生物指示劑。對滅菌手段耐受性差的產(chǎn)品，設計滅菌程序時，根據(jù)經(jīng)驗預計在該生產(chǎn)工藝中產(chǎn)品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子數(shù)量。這類產(chǎn)品的無菌保證應通過監(jiān)控每批滅菌前的微生物污染的數(shù)量、耐受性和滅菌程序驗證所獲得的數(shù)據(jù)進行評估 4.常用生物指示劑
(1)濕熱滅菌法：濕熱滅菌法**常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。D值為1.5～3.0min，每片（或每瓶）活孢子數(shù)5×105～5×106個，在121℃、19min下應被完全殺滅。此外，還可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes如NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955)，D值為0.4～0.8min。 #p#分頁標題#e#
(2)干熱滅菌法：干熱滅菌法**常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如NCIMB 8058、ATCC 9372)。D值大于1.5min，每片活孢子數(shù)5×105～5×106個。去熱原驗證時使用大腸桿菌內毒素（Escherichia coli endoxin），加量不小于1000細菌內毒素單位。
(3) 輻射滅菌法：輻射滅菌法**常用的生物指示劑為短小芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus pumilus，如NCTC 10 327、NCIMB 10 692、ATCC 27 142)。每片活孢子數(shù)107～108，置于放射劑量25kGy條件下，D值約3kGy。但應注意滅菌產(chǎn)品中所負載的微生物可能比短小芽孢桿菌孢子顯示更強的抗輻射力。因此短小芽孢桿菌孢子可用于監(jiān)控滅菌過程，但不能用于滅菌輻射劑量的建立。
(4) 氣體滅菌法：環(huán)氧乙烷滅菌**常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus
subtilis，如NCTC 10 073、ATCC 9372)。氣態(tài)過氧化氫滅菌**常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。每片活孢子數(shù)1×106～5×106個。環(huán)氧乙烷滅菌中，枯草芽孢桿菌孢子D值大于2.5min，在環(huán)氧乙烷濃度為600mg/L，相對濕度為60%，溫度為54℃下滅菌，60min應被殺滅。
⑸ 過濾除菌法：過濾除菌法**常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta,如
ATCC19 146)，用于濾膜孔徑為0.22μm的濾器；黏質沙雷菌(Serratin marcescens)(ATCC 14 756)，用于濾膜孔徑為0.45μm的濾器 。 有效期。載體和包裝材料在保護生物指示劑不被污染和損耗的同時，還應保證滅菌劑穿透并能與生物指示劑充分接觸。載體和包裝應設計原則是便于貯存、運輸、取樣、轉移接種。
有些生物指示劑可直接將孢子接種**液體滅菌物或具有與其相似的物理和化學特性的替代品中。使用替代品時，應用數(shù)據(jù)證明二者的等效性。
1. 2. 生物指示劑的應用
在滅菌程序的驗證中，盡管可通過滅菌過程某些參數(shù)的監(jiān)控來評估滅菌效果，但生物指示劑的被殺滅程度，則是評價一個滅菌程序有效性**直觀的指標。可使用市售的標準生物指示劑，也可使用由日常生產(chǎn)污染菌監(jiān)控中分離的**耐受微生物制備的孢子。在生物指示劑驗證試驗中，需確定孢子在實際滅菌條件下的耐受性，并測定孢子的純度和數(shù)量。驗證時，生物指示劑的微生物用量應比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強，以保證滅菌程序有更大的安全性。在**終滅菌法中，生物指示劑應放在滅菌柜的不同部位。并避免指示劑直接接觸到被滅菌物品。生物指示劑按設定的條件滅菌后取出，分別置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定生物指示劑中的孢子是否被完全殺滅。
過度殺滅產(chǎn)品滅菌驗證一般不考慮微生物污染水平，可采用市售的生物指示劑。對滅菌手段耐受性差的產(chǎn)品，設計滅菌程序時，根據(jù)經(jīng)驗預計在該生產(chǎn)工藝中產(chǎn)品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子數(shù)量。這類產(chǎn)品的無菌保證應通過監(jiān)控每批滅菌前的微生物污染的數(shù)量、耐受性和滅菌程序驗證所獲得的數(shù)據(jù)進行評估。 4.常用生物指示劑
(1)濕熱滅菌法：濕熱滅菌法**常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。D值為1.5～3.0min，每片（或每瓶）活孢子數(shù)5×105～5×106個，在121℃、19min下應被完全殺滅。此外，還可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes如NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955)，D值為0.4～0.8min。
(2)干熱滅菌法：干熱滅菌法**常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如NCIMB 8058、ATCC 9372)。D值大于1.5min，每片活孢子數(shù)5×105～5×106個。去熱原驗證時使用大腸桿菌內毒素（Escherichia coli endoxin），加量不小于1000細菌內毒素單位。
(3) 輻射滅菌法：輻射滅菌法**常用的生物指示劑為短小芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus pumilus，如NCTC 10 327、NCIMB 10 692、ATCC 27 142)。每片活孢子數(shù)107～108，置于放射劑量25kGy條件下，D值約3kGy。但應注意滅菌產(chǎn)品中所負載的微生物可能比短小芽孢桿菌孢子顯示更強的抗輻射力。因此短小芽孢桿菌孢子可用于監(jiān)控滅菌過程，但不能用于滅菌輻射劑量的建立。
(4) 氣體滅菌法：環(huán)氧乙烷滅菌**常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus
subtilis，如NCTC 10 073、ATCC 9372)。氣態(tài)過氧化氫滅菌**常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。每片活孢子數(shù)1×106～5×106個。環(huán)氧乙烷滅菌中，枯草芽孢桿菌孢子D值大于2.5min，在環(huán)氧乙烷濃度為600mg/L，相對濕度為60%，溫度為54℃下滅菌，60min應被殺滅。⑸ 過濾除菌法：過濾除菌法**常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta,如
ATCC19 146)，用于濾膜孔徑為0.22μm的濾器；黏質沙雷菌(Serratin marcescens)(ATCC 14 756)，用于濾膜孔徑為0.45μm的濾器 。 </FONT< p>#p#分頁標題#e#
常用滅菌法 一、物理滅菌法：
（一）熱力滅菌法：1、干熱滅菌法： 是利用火焰或干熱空氣進行滅菌，大多用于用具及器皿等。 2、濕熱滅菌法：(1)熱壓滅菌法：用飽和水蒸汽排盡空氣后，在一定溫度和壓力下進行滅菌。水蒸汽壓力與溫度對應如下：
20.594(kpa)-105.7℃，34.3233-108.8℃，41.1879-110.3℃，68.6466-115.5℃，75.1121-116.8℃，96.1052-120.2℃……
(2)流通蒸汽滅菌法和煮沸滅菌法：100℃，適用于不耐高溫的藥劑。
(3)低溫間歇滅菌法：80℃加熱1小時，20～25℃下放置24小時，連續(xù)操作三次以上，適用于不耐熱藥劑，滅菌效果差，須加防腐劑。
（二）過濾滅菌法：1、垂熔玻璃濾器：G際標準為P250～P2，濾過粒子由大到小。P2可濾除大腸桿菌及葡萄球菌。
2、微孔濾膜：我G為醋酸纖維素酯濾膜，或硝酸纖維素酯與醋酸纖維素酯的混合纖維素酯濾膜。特性：耐120℃30分鐘滅菌；無脫屑；不耐堿；不耐有機溶劑；易燃。孔徑 5.0mm用于注射液初濾，0.8mm用于精濾，0.45mm可濾去大多數(shù)細菌，0.15mm可濾去熱原。
（三）紫外線滅菌法：波長200～300nm，易穿透潔凈的水和空氣，用于空氣和物體表面滅菌。紫外線燈有效使用期一般為3000小時。 紫外線照射時間對微生物殺滅率見表： 照射時間（小時） 殺 滅 率 （%）
（四）微波滅菌法：為300～3000兆赫的電磁波。水可強烈吸收微波，使極性分子轉動摩擦而產(chǎn)熱。能穿透物質較深部，滅菌效果好。有望用于注射液的滅菌。
（五）輻射滅菌法：又稱電離輻射，是用g-射線或b-射線照射殺菌。前者由鈷-60或銫-137發(fā)出，穿透力強；后者由電子加速器產(chǎn)生，帶電荷，穿透力弱，滅菌效果差。對于輻射，無芽胞菌比有芽胞菌敏感得多；無芽胞菌中革蘭氏陰性菌比陽性菌敏感；而病毒敏感性很差。此外，輻射能引起一些藥物pH值、含量、活性等改變，某些制品不宜選用。
二、化學滅菌法：一般以噴灑（霧）、蒸發(fā)等方法進行滅菌。
（一）環(huán)氧乙烷：無色醚樣臭味氣體，沸點10.8℃，沸點以下為無色透明液體，比重0.882，溶于水。擴散穿透能力強，屬廣譜殺菌劑。用于對熱敏感的藥物、塑料、橡膠、皮革制品、皮料、紙張以及小型玻璃器皿等的滅菌。
（二）過氧乙酸：無色透明液體，有刺激性醋酸臭和味，易揮發(fā)，有腐蝕性。易溶于水、乙醇、乙醚、醋酸。可緩慢分解，急劇分解時會爆炸。但40%以下的溶液則不會。本品廣譜、高效、速效，毒性低，0.5%溶液用于空氣（噴霧30ml/m3）、器械和皮膚消毒，臨用前配制。
（三）其它：1、苯酚（石炭酸）：3～5%地面、墻壁噴撒。 2、甲酚皂溶液（來蘇爾）：5～100%地面、墻壁噴撒。
3、甲醛溶液（福爾馬林）：20ml/m3加熱蒸發(fā),6～12小時。 4、乳酸：1ml/m3加熱蒸發(fā)0.5～1小時。 5、苯扎溴銨：1/1000～1/2000溶液噴撒地面、墻壁。 6、丙二醇：1ml/m3加熱蒸發(fā)
